Результаты I и II фаз клинических испытаний вакцины Казфлювак

Для предотвращения пандемии гриппа A/H5N1 компании, производящие гриппозные вакцины, осуществляют разработку наряду с другими видами цельновирионную вакцину против вируса гриппа птиц H5N1. К настояшему времени среди цельновирионных инактивированных вакцин против гриппа A/H5N1 зарегистрированы вакцины компании Omnivest (Венгрия), Biken, Denka Seiken, Kitasato Institute, Kaketsuken (Япония), GSK Biologicals (Бельгия), Sinovac Biotech (Китай). Все они получены на основе куриных эмбрионов и в качестве адъюванта используется алюминий. Различия между ними состоят в различной антигенной нагрузке и в схемах вакцинации. Вакцину Fluval (Венгрия) применяют однократно, при этом концентрация гемагглютинина составляет 6 мкг/дозу. Остальные вакцины, перечисленные выше, применяют методом двукратной иммуниза ции, а содержание гемагглютинина колеблется в пределах 10-15 мкг на дозу.
С целью обеспечения специфической профилактики гриппа A/H5N1 в Республике Казахстан (РК) НИИ проблем биологической безопасности РК совместно с НИИ Гриппа СЗО РАМН РФ разработали препарат Казфлювак, представляющий собой инактивированную цельновирионную гриппозную моновакцину с гидрооксидом алюминия. Препарат произведен на основе вакцинного штамма A/Astana/RG6:2/09, относящегося к эндемичному для территории Казахстана и России 2 клайду 2 субклайда вирусов гриппа A/H5N1. Штамм получен методом обратной генетики и содержит гены НА (с модификацией сайта патогенности) и NA вируса гриппа A/Astana/6/2005 (H5N1), и PA, PB1, PB2, NP, M и NS гены от высокоурожайного штамма A/PR/8/34.
Вакцина произведена на производственной базе НИИ проблем биобезопасности КН МОН РК. Экспертиза нормативной документации и лабораторный контроль экспериментальных серий вакцины Казфлювак проведены в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
В предлагаемой работе приводятся результаты анализа I и II фазы клинических испытаний, которые были проведены с 5 июля по 15 октября 2010 года (I фаза) в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, г. Москва, РФ, и с 8 июля по 30 июня 2011 года (II фаза) в ФГБУ НИИ гриппа, г. Санкт-Петербург, и НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, г. Москва, РФ. Исследования проведены в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации» (Приказ МЗ РФ № 266 от 19.06.2003 г.), Хельсинской декларацией, принятой XVII сессией Всемирной ассамблеи здравоохранения (1964 г.) и пересмотренной на сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения в 2000 г., а также требованиями национального законодательства.

Результаты
Задачами I фазы данного исследования являлись оценка безопасности и переносимости вакцины Казфлювак, а также системного иммунного ответа при вакцинации добровольцев при двукратном внутримышечном введении.
Было проведено рандомизированное, слепое, плацебо-контролируемое по двукратному с увеличением дозы исследование по оценке безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины Казфлювак у добровольцев в возрасте 18-60 лет. В исследование было запланировано включить 34 здоровых добровольца (12 человек для вакцинации вакциной в дозе 7.5 мкг НА, 11 человек – вакциной в дозе 15 мкг НА/дозу), которые методом случайной выборки (метод рандомизации) были распределены в соотношении 2:1 на получающих вакцину или плацебо (11 человек).
Вакцинация добровольцев препаратом Казфлювак осуществлялась в режиме двух уровней доз 7.50 или 15.00 мкг гемагглютинина (НА на 1 человека) (табл.1)



Table 1. Scheme of dose increase

Dose level Containment of HA/dose for 1 person Amount of volunteers vaccinated with Kazfluvac Amount of volunteers injected with placebo
I 7,5 µg 12 6
II 15 µg 11 5

В исследование были включены только те добровольцы, у которых по данным РТГА выявлены титры антител 1:10 к подтипу вируса гриппа А/H5N1 и которые по данным ИФА были серонегативны к ВИЧ, гепатиту С и В.
Вакцина Казфлювак и препарат плацебо вводились двукратно внутримышечно в объеме 0.5 мл в область дельтовидной мышцы недоминирующей руки в 1-й и 21 день исследования. Вакцина вводилась в дозе 7.5 мкг или 15 мкг гемагглютинина (НА) на 1 человека. Для клинических исследований были использованы по одной из трех экспериментальных серий вакцины каждой дозы (содержание НА 7.5 мкг/дозу и 15 мкг/дозу), прошедшие необходимые контроли качества в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Для вакцинации добровольцев были использованы следующие серии вакцины Казфлювак: 1/1-0210; 1/2-0210, содержащие 7.5 мкг или 15 мкг гемагглютинина (НА) соответственно, или препарат плацебо.

В течение 7 дней после первой вакцинации и после второй вакцинации (между 21-м и 27-м днями) проводилось активное наблюдение за состоянием здоровья добровольцев для оценки выраженности местных и общих реакций. Все случаи возникновения побочных реакций и применения соответствующего лечения регистрировались исследователем в соответствующих ИРК, начиная с введения вакцины до окончания исследования (42 дня).

Лабораторные анализы (клинический и биохимический анализы крови, анализ мочи), определение уровня общих IgE проводились в клинико-диагностической лаборатории НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, скрининговые и серологические исследования (РТГА, РМН) были проведены в клинико-диагностической лаборатории НИИ гриппа СЗО РАМН РФ.

Оценка иммуногенности вакцины Казфлювак основывалась на определении гуморального иммунного ответа по следующим параметрам: среднегеометрический титр антител, фактор сероконверсии, уровень сероконверсии, уровень серопротекции. Замеры показателей проводились на 1-й (до вакцинации), 21-й день и 42 день исследования.

Оценка реактогенности и безопасности вакцины была проведена по следующим показателям: выраженность и связь с вакцинацией наблюдаемых местных и системных реакций в течение 7 дней после вакцинации, анализ результатов лабораторных исследований на 1-й, 7-й, 21-й, 27-й и 42-й дни исследования.

Исследование было проведено с участием 34 здоровых добровольцев обоего пола в
возрасте от 18 до 60 лет, соответствующих требованиям критериев включения/невключения. Распределение добровольцев по полу и возрасту, их базовые демографические данные представлены в таблице 2.





Table 2. Age and sex distribution of volunteers

Demographic data Kazfluvac vaccine dose level Placebo
N=11
7,5 µg НА
N=11 15 µg НА
N=11
Sex
Men 4 (66,7%) 5 (45,5%) -
Women 8 (33,3%) 6 (54,5%) 11 (100%)
Age (years)
Average 41 25,5 40
Min.- Max. 22 – 58 22 - 53 33 - 59

Всего в ходе исследования оценки безопасности вакцины были отмечены 22 нежелательных явлений (НЯ - любой неблагоприятный и неожиданный признак, симптом или заболевание, по времени связанные с использованием медицинского продукта) у 21 из 34 добровольцев (61,8%); во всех случаях возникновения НЯ взаимосвязь с введением препарата была оценена как вероятная (таблица 3).

Table 3. Undesirable effects observed during the trial

Group (amount of volunteers) Amount of volunteers with the observed reactions during 7 days after vaccination
Local reactions Systemic reactions
Slight Middle Serious Slight Middle Serious
After 1st vaccination
Vaccine 7,5 µg of HA (12 volunteers) 4 (33,3%) - - - - -
Vaccine 15 µg of НА (10 volunteers) 6 (60%) - - 1 (10%) - -
Placebo
(12 volunteers) - - - - - -
After 2nd vaccination
Vaccine 7,5 µg of HA (12 volunteers) 3 (25%) - - - - -
Vaccine 15 µg of НА (10 volunteers) 8 (80%) - - - - -
Placebo
(12 volunteers) - - - - - -

Среди нежелательных явлений, связанных с введением препарата, 21 НЯ представляли собой местные реакции легкой степени выраженности: в 95% случаев – боль в месте инъекции длительностью до 3-х дней, в 25% случаев сопровождающаяся гиперемией диаметром до 50 мм и/или в 15% случаев – инфильтратом диаметром до 25 мм. У одного добровольца, привитого вакциной в дозе 15 мкг НА, была отмечена системная реакция легкой степени выраженности в виде ломоты в суставах в течение 1 дня, боли в горле и кашля в течение 7 дней.

Существенных различий по частоте возникновения НЯ после первой и после второй вакцинаций в обеих группах отмечено не было, однако количество НЯ в группе добровольцев, привитых вакциной с содержанием активного компонента 15 мкг было выше, чем в группе привитых вакциной низкого уровня дозы, то есть наблюдались дозо-зависимые различия по частоте возникновения местных поствакцинальных реакций. Побочных реакций тяжелой степени выраженности зарегистрировано не было. Ни в одном случае возникновения НЯ не требовалось проведения дополнительной терапии, ни один из добровольцев не был исключен из исследования в связи с возникновением НЯ. Серьезных нежелательных явлений в ходе исследования отмечено не было.

Согласно Европейским критериям ежегодной регистрации сезонных инактивированных гриппозных вакцин (ИГВ) для лиц в возрасте 18-60 лет вакцинация должна приводить к увеличению среднегеометрического титра антител в 2,5 раза; к 4-х кратным сероконверсиям у 40% и более лиц; число лиц с защитными титрами антител должно составлять более 70%. Следует отметить, что критерии оценки иммуногенной активности для противогриппозных вакцин H5N1 не определены.
Оценка иммуногенной активности вакцины Казфлювак при однократном введении по данным РТГА через 21 день после вакцинации показала, что в группе привитых вакциной Казфлювак в дозе 7.5 мкг НА доля лиц с 4-х кратными сероконверсиями составила 66,7%; кратность прироста титров антител составила 3,4; уровень серопротекции – 16,7%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа А/H5N1 – 16,8.

После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Казфлювак в дозе 7.5 мкг НА было отмечено увеличение всех показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность прироста титров антител достигли 28,0 и 5,7 соответственно; уровень серопротекции достиг 66,7%, доля лиц с 4-х кратными сероконверсиями составила 75%. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) после первой вакцинации доля лиц с 4-х кратными сероконверсиями составила 90,9%; кратность прироста титров антител составила 8,0; уровень серопротекции – 72,7%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа А/H5N1 – 40,0. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Казфлювак в дозе 15 мкг НА также было отмечено увеличение большинства показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность прироста титров антител достигли 54,4 и 10,9 соответственно; уровень серопротекции достиг 90,9%, доля лиц с 4-х кратными сероконверсиями составила 90,9%. Результаты, полученные при постановке теста микронейтрализации, были сопоставимыми с РТГА.

Table 4. Kazfluvac vaccine immunogenic activity

Preparation
(amount of persons) Amount of persons with 4-fold seroconversion Average geometric antibodies titers Degree of antibodies titers increase Amount of persons with protective antibodies titers (≥1:40)
Vaccination Vaccination Vaccination Vaccination
First Second First Second First Second First Second
MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT
Vaccine
7,5 µg НА
n=12 75,0

66,7 100,0

75,0 30,0

16,8 53,4

28,3 5,0

3,4 9,0

5,7 25,0

16,7 50,0

66,7
Vaccine
15 µg НА
n=12 81,8

90,9 100,0

90,9 58,4

40,0 117,6

54,4 9,7

8,0 18,7

10,6 54,5

72,7 90,9

90,9

По параметрам иммуногенности по данным РТГА с лошадиными эритроцитами и РМН вакцина Казфлювак с содержанием НА 7.5 мкг/дозу и 15 мкг/дозу после однократного введения удовлетворяла 2-м из 3-х Европейских критериев ежегодной регистрации сезонных инактивированных гриппозных вакцин (ИГВ).

Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины Казфлювак в дозах 7,5 мкг и 15 мкг НА при одно- и двукратной внутримышечной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет свидетельствует о хорошей переносимости, низкой реактогенности и безопасности вакцины, а также о достаточной иммуногенной активности вакцины в отношении вируса гриппа A/H5N1 при одно- и двукратном введении. Полученные результаты позволили проведение II фазы клинических исследований с целью выбора оптимальной дозы вакцины Казфлювак (7,5 или 15 мкг гемагглютинина на 1 человека) при однократном введении добровольцам в возрасте от 18 до 60 лет.

Основной задачей II фазы исследования являлась оценка иммуногенности вакцины при однократном внутримышечном введении. Оценка показателей иммуногенной активности вакцины проводилась по следующим критериям: выработке гемагглютинин-ингибирующих антител в образцах сыворотки крови по данным РТГА, а также по выработке нейтрализующих антител по данным РМН (1-й день – перед вакцинацией, 21-й день). Также была проведена оценка безопасности и переносимости вакцины Казфлювак при однократном введении.

Для этой цели было проведено рандомизированное, слепое исследование по однократному применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Казфлювак) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. В исследование были включены только те добровольцы, у которых по данным РТГА выявлены титры антител ≤ 1:10 к подтипу вируса А/H5N1 и которые по данным ИФА были серонегативны к ВИЧ, гепатиту В и С. В исследование было включено 80 здоровых добровольцев. Вакцинация добровольцев препаратом Казфлювак осуществлялась в режиме двух уровней доз (7.5 или 15 мкг гемагглютинина на 1 человека).
Исследование было проведено на двух клинических базах: ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития РФ, г. Санкт-Петербург (40 добровольцев) и НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН РФ, г. Москва (40 добровольцев).
Для вакцинации добровольцев были использованы следующие серии вакцины Казфлювак: с. 1 – 7,5 мкг НА; с.1 – 15 мкг НА, содержащие 7,5 мкг или 15 мкг гемагглютинина соответственно. Вакцину вводили однократно внутримышечно в объеме 0,5 мл в область дельтовидной мышцы недоминирующей руки в 1-й день исследования. Вакцинированные лица находились под тщательным наблюдением врачей в течение 7 дней после вакцинации для оценки выраженности местных и общих реакций. Регистрация нежелательных явлений велась проспективно в течение всего периода исследования.
Исследование было проведено с участием 80 здоровых добровольцев обоего пола в возрасте от 18 до 60 лет, соответствующих требованиям критериев включения/невключения. Распределение добровольцев по полу и возрасту, их базовые демографические данные представлены в таблице 5.

Table 5. Age and sex distribution of volunteers.


Index Volunteers cohort Kazfluvac (7,5 µg НА) Kazfluvac (15 µg НА)
Total Women Men Total Women Men Total Women Men
Amount of persons 80 41 39 40 17 23 40 24 16

51,25% 48,75% 42,5% 57,5% 60,0% 40,0%
Age
(years) 35,3±11,4 36,9±11,25 33,5±11,4 34,4±11,0 35,1±9,8 33,8±12,0 36,1±11,8 38,6±12,2 33,1±11,0
Me 34,5 38,0 31,0 34,0 34,0 30,0 41,0 42,5 31,0
min 19,0 19,0 20,0 20,0 22,0 20,0 19,0 19,0 20,0
max 58,0 57,0 58,0 58,0 55,0 58,0 57,0 57,0 55,0
95%CI 32,7-37,8 33,4-40,5 29,8-37,2 30,8-37,9 28,5-39,1 28,5-39,1 32,4-39,8 33,1-43,4 27,4-38,7

Добровольцы по демографическим характеристикам и возрасту были распределены равномерно среди групп, получивших вакцину двух уровней доз.
Оценка иммуногенной активности вакцины при однократном введении через 21 день после вакцинации показала, что в группе привитых вакциной Казфлювак в дозе 7.5 мкг НА доля лиц с 4-х кратными сероконверсиями составила 55,0%; уровень серопротекции составил 55,5%; кратность прироста титров антител составила 3,4; среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа А/H5N1 – 17,1.
В группе привитых вакциной Казфлювак в дозе 15 мкг НА было отмечено увеличение всех показателей иммуногенной активности вакцины: доля лиц с 4-х кратными сероконверсиями составила 70,0%; СГТ и кратность прироста титров антител достигли 23,4 и 4,68 соответственно; уровень серопротекции составил 57,5% Результаты, полученные при постановке реакции микронейтрализации (РМН) были сопоставимы с результатами РТГА. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) по данным РМН наблюдалось увеличение всех изученных показателей иммуногенной активности вакцины: доля лиц с 4-х кратными сероконверсиями составила 67,5%; кратность прироста титров антител составила 7,6; уровень серопротекции – 55,0 %, среднегеометрические титры антител к вирусу гриппа A/H5N1 – 42,87. Это указывает на дозо-зависимый характер формирования антительного ответа. Данные показателей иммуногенной активности вакцины Казфлювак по данным РТГА и РМН представлены в таблице 6.
Table 6. Kazfluvac vaccine immunogenic activity.

Preparation
(amount of persons) Amount of persons with 4-fold seroconversion Average geometric antibodies titers Degree of antibodies titers increase Amount of persons with protective antibodies titers (≥1:40)
HAIT MNT HAIT MNT HAIT MNT HAIT MNT
Vaccine
7,5 µg НА
n=40 55,0 55,0 17,1 24,2 3,42 4,2 52,5 40,0
Vaccine
15 µg НА
n=40 70,0 67,5 23,38 42,87 4,68 7,6 57,5 55,0


Для оценки безопасности исследуемых препаратов был проведен анализ нежелательных явлений (НЯ) на основании результатов лабораторно-инструментальных обследований (АД, ЧСС, температура тела, ЭКГ-обследование, гематологический, биохимический анализы крови, общий анализ мочи), результатов физикального осмотра, медицинского анамнеза.
Всего в ходе исследования были отмечены 29 нежелательных явлений (НЯ) у 29 из 80 привитых добровольцев (36,25%); в 28 случаях возникновения НЯ взаимосвязь с введением препарата была оценена как вероятная, в одном случае как несвязанная. Среди нежелательных явлений, связанных с введением препарата, 25 НЯ представляли собой местные реакции легкой степени выраженности: в 100% случаев – незначительная боль в месте инъекции длительностью до 2-х дней, не сопровождающаяся гиперемией и инфильтратами, исчезала без применения лекарственных средств. У одного добровольца, привитого вакциной в дозе 7.5 мкг НА, была отмечена системная реакция легкой степени выраженности в виде насморка, першения в горле на 3-4 дни после вакцинации; у двух добровольцев, привитых вакциной в дозе 15 мкг НА, были отмечены системные реакции легкой степени выраженности в виде недомогания и першения в горле на второй день после вакцинации и головной боли на второй день после вакцинации. Нежелательных явлений тяжелой и средней степени выраженности зарегистрировано не было.

Изменения результатов клинико-лабораторных обследований добровольцев на 7-й и 21-й дни после вакцинации от первоначальных показателей, включая уровень общих IgE, происходили в пределах нормальных физиологических значений вне зависимости от дозы вакцины.
Results of clinical and laboratory surveillance of volunteers including level of IgE on the 7th and 21st days post vaccination differed from primary results within normal physiologic values and irrespective of the vaccine dose.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение иммуногенной активности, реактогенности и безопасности вакцины Казфлювак в дозах 7.5 мкг и 15 мкг НА при однократной внутримышечной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет свидетельствует о хорошей переносимости, низкой реактогенности и безопасности вакцины, а также о достаточной иммуногенной активности вакцины в отношении вируса гриппа A/H5N1. Полученные результаты позволяют рекомендовать вакцину Казфлювак в дозе 7.5 мкг НА/дозу для государственной регистрации в качестве профилактического средства защиты населения в возрасте от 18 до 60 лет от гриппа А подтипа H5N1.

REFERENCES
1. Federal law concerning medical agents # 122-F3 signed 22.08.2004
2. Order of Ministry of Health of RF # 266 signed 19.06.2003 “Rules of Clinical Practice in Russian Federation”
3. National standard of Russian Federation “Good Clinical Practice” # 232-st. signed 27 September, 2005.
4. Yu. B. Beloussov “Planning and Implementing of Clinical Trials of Medical Agents” М. 2000.
5. Li, H., Nookala, S. & Re, F. (2007). Aluminum hydroxide adjuvants activate caspase-1 and induce IL-1 beta and IL-18 release. J Immunol 178, 5271-5276.
6. Vajo Z, Wood J, Koza L, Szilvasy I, Paragh G, Pauliny Z, Bartha K, Visontay I, Kis A, Jankovcs I. A single-dose influenza A (H5N1) vaccine safe and immunogenic in adult and eldery patients: an approach to pandemic vaccine development. J Virol. 2010; 84(3):1273-42
7. Fazekas G, Martosne-Mendi R, Jankovcs I, Szilvasy I, Vajo Z. Cross-reactive immunity to clade 2 strains of influenza virus A subtype H5N1 induced in adults and eldery patients by Fluval, a prototype pandemic influenza virus vaccine derived by reverse genetics, formulated with a phosphate adjuvant, and directed to clade 1 strains. Clin Vaccine Immunol. 2009 16(4):437-43
8. Seidigapbar M. Mamadaliyev, Nurlan T. Sandybayev, Zhailaubay K. Kydyrbayev, Berik M. Khairullin, Oleg I. Kiselev, Ludmila M. Tsybalova, Michail P. Grudinin, Aleksandr I. Migunov. Basic results of development of a production technology and control of a pandemic influenza A/H5N1 vaccine. Influenza and Respiratory Viruses, 5 (Suppl.1), 328-394
9. Seidigapbar M. Mamadaliyev, Nurlan T. Sandybayeiv, Yevgeni N. Troitskiy, Zhailaubay K. Kydyrbayiev, Berik M. Khairullin, Oleg I. Kisselev, Liudmila M. Tsybalova, Kenes S. Ospanov, Stanislav V. Kazakov. The Development of Native Vaccine and Diagnostic Biopreparations against Influenza A/H5N1 and A/H1N1 – the Basis of Biologic Safety and Protection for Population of the Republic of Kazakhstan. Proc. “AntiInfluenza Vaccines of New Generation”, St. Peterburg 28-29 October, 2009 P. 4-11
10. Methods of Control of Medical and Immune Biological Preparations Injected to Humans. Methodic Instructions MUK 4.1/4.2.588-96 (Approved GOSCOMEPIDNADZOR RF 31.10.1996)
11. RD 42-28-10-90. “Order and Methods of Control of Immune Biological Safety of Vaccines. General Methodic Principles”, Moscow – 1989

Results of I and II phases of Kazfluvac vaccine clinical trials
Seidigapbar M. Mamadaliyev, Nurlan T. Sandybayiev, Zhailaubay K. Kydyrbayiev, Berik M. Khairullin, Kaissar K. Tabynov, Markhabbat M. Kassenov,
Oleg I. Kisselev, Liudmila M. Tsybalova, Marina A. Stukova, Yerofeeva, Kostina.
1 – Research Institute for Biological Safety Problems, Gvardeiskiy, the Republic of Kazakhstan;
2- FBGA Influenza Research Institute, St. Petersburg, Russian Federation

For the influenza A/H5N1 pandemic control many companies producing influenza vaccines develop whole – virion vaccine against H5N influenza virus along with the other kinds of influenza vaccines. Nowadays among whole-virion inactivated influenza H5N1 vaccines the following companies registered their vaccines: Omnivest (Hungary), Biken, Denka Seiken, Kitasato Institute, Kaketsuken (Japan), GSK Biologicals (Belgium), Sinovac Biotech (China).
All those vaccines are produced on the basis of chicken embryos and contain aluminum as adjuvant. The differences between them are in various antigenic loading and in various schemes of vaccination. Fluval vaccine (Hungary) is applied once and hemagglutinin concentration is 6µg per dose. The other vaccines mentioned above are applied by the method of double immunization and hemagglutinin concentration is between 10-15 µg per dose.
Aiming at providing of H5N1 influenza specific prophylaxis in the Republic of Kazakhstan the Research Institute for Biological Safety Problems together with the Influenza Research Institute NWD RAMS RF have developed Kazfluvac biopreparation which is inactivated whole virion influenza monovaccine containing hydroxide aluminum. The vaccine is developed on the basis of vaccine strain A/Astana/RG6:2/09 referring to endemic for Kazakhstan and Russia 2 clade of 2 subclade of influenza H5N1 viruses. The strain is obtained by the method of reverse genetics and contains HA gene (with the modification of pathogenicity site) and NA gene taken from A/Astana/6/2005 (H5N1) strain and PA, PB1, PB2, NP, M and NS genes taken from high – yielding strain A/PR/8/34.
The vaccine is produced in the Research Institute for Biological Problems CS ME&S RK manufacturing base. Expertise of all normative documentation for the vaccine and laboratory control of experimental series of Kazfluvac vaccine has been implemented in FGOS Governmental Institute of Standard and Control after the name of L.A. Tarassevich.
In this work we represent the analysis of the results of I and II phases of clinical trials which were conducted in 5th of July – 15th of October 2010 (I phase) in Research Institute of Vaccines and Sera after the name of I.I. Mechnikov, Moscow, Russian Federation and in 8th of June – 30th of June 2011 (II phase) in Influenza Research Institute, St. Peterburg and in Research Institute of Vaccines and Sera after the name of I.I. Mechnikov, Moscow, Russian Federation. The clinical trials have been implemented according to “Rules of Clinical Practice in Russian Federation” (RF Ministry of Health Order #266 signed in 19.06.2003), Helsinki Declaration adopted by XVII session of World Health Assembly (1964) and reviewed in World Health Assembly in 2000 and rules and requirements of national law.

Results
The tasks of the I phase of the clinical trial have been evaluation of safety and tolerance of Kazfluvac vaccine and evaluation of systemic immune response after double intramuscular vaccination.
Randomised blind placebo-controlled clinical trials of the vaccine double application with dose increase on volunteers of 18 – 60 age have been conducted for evaluation of the Kazfluvac vaccine safety, tolerance and immunogenicity. 34 healthy volunteers have been involved in the trial (12 volunteers have been chosen for vaccination by the vaccine containing 7,5 µg of HA per dose and 11 volunteers - for vaccination by the vaccine containing 15µg of HA per dose) which have been divided by the method of randomization in 2:1 ratio into vaccinated volunteers and placebo-injected volunteers (11 volunteers).
Vaccination of volunteers with Kazfluvac vaccine has been conducted in two doses: 7,5 and 15 µg of HA per one person (Table 1).


Table 1. Scheme of dose increase

Dose level Containment of HA/dose for 1 person Amount of volunteers vaccinated with Kazfluvac Amount of volunteers injected with placebo
I 7,5 µg 12 6
II 15 µg 11 5

Only volunteers who had antibodies titers 1:10 to the A/H5N1 influenza virus subtype in HAIT and who was seronegative in ELISA to HIV and hepatitis C and B have been involved in the trial.
Kazfluvac vaccine and placebo have been injected twice intramuscularly in volume of 0,5 ml in deltoid muscle of non – dominating hand on the 1st and 21st days of trial. The vaccine has been injected in doses 7,5 or 15 µg of HA per one person. For the clinical trial we used one of three experimental series of vaccine of each dose (HA containment 7,5 µg per dose and 15 µg per dose) which underwent all necessary quality control in FG after the name of L.A. Tarassevich. For the vaccination the following series of Kazfluvac vaccine have been used: 1/1-0210; 1/ 2-0210, containing 7,5 µg or 15 µg of HA accordingly or placebo.
During 7 days after first vaccination and after second vaccination (between 21st and 27th days) active surveillance of the volunteers’ health status has been conducted for the evaluation of intensity of local and general reactions. Beginning with the day of vaccination and till the end of trial (42 days) all cases of side effects and their treatment have been registered by the researchers in individual registration cards.
Laboratory analysis (clinical and biochemical analysis of blood, analysis of urine) determination of IgE level has been conducted in clinical and diagnostic laboratory of Research Institute of Vaccines and Sera after the name of I.I. Mechnikov, and screening and serologic studies (HAIT, MR) have been conducted in clinical and diagnostic laboratory of Influenza Research Institute NWD RAMS RF.
Evaluation of immunogenicity of Kazfluvac vaccine has been based on the determination of humoral immune response according to the following parameters: average geometric antibodies titer, seroconversion factor, seroconversion level, seroprotection level. Measurement of those parameters has been conducted on the 1st (before vaccination), 21st and 42nd days of trial.
Evaluation of reactogenicity and safety of the vaccine has been conducted according to the following parameters: effect of vaccination on the observed local and systemic reactions and their intensity during 7 days after vaccination, analysis of the results of laboratory studies on the 1st, 7th , 21st, 27th and 42nd days of trial.
The clinical trial has been implemented with the participation of 34 healthy volunteers of both sexes in 18-60 age complying with the requirements of the inclusion/non-inclusion criteria. Age and sex group distribution of volunteers and their basic demographic data are represented in Table 2.







Table 2. Age and sex distribution of volunteers

Demographic data Kazfluvac vaccine dose level Placebo
N=11
7,5 µg НА
N=11 15 µg НА
N=11
Sex
Men 4 (66,7%) 5 (45,5%) -
Women 8 (33,3%) 6 (54,5%) 11 (100%)
Age (years)
Average 41 25,5 40
Min.- Max. 22 – 58 22 - 53 33 - 59

Totally during the study of evaluation of the vaccine safety 22 undesirable effects has been observed in 21 from 34 volunteers (61,8%). Undesirable effect is an unfavorable or unexpected sign, symptom or disease connected with the use of a medical biopreparation. In all cases of undesirable effects there has been probable interrelation between vaccination and undesirable effect (Table 3).

Table 3. Undesirable effects observed during the trial

Group (amount of volunteers) Amount of volunteers with the observed reactions during 7 days after vaccination
Local reactions Systemic reactions
Slight Middle Serious Slight Middle Serious
After 1st vaccination
Vaccine 7,5 µg of HA (12 volunteers) 4 (33,3%) - - - - -
Vaccine 15 µg of НА (10 volunteers) 6 (60%) - - 1 (10%) - -
Placebo
(12 volunteers) - - - - - -
After 2nd vaccination
Vaccine 7,5 µg of HA (12 volunteers) 3 (25%) - - - - -
Vaccine 15 µg of НА (10 volunteers) 8 (80%) - - - - -
Placebo
(12 volunteers) - - - - - -

Among undesirable effects due to the vaccination 21 effects were local reactions of slight intensity. In 95% of cases it was pain in the place of injection which lasted up to 3 days and in 25% of cases it was accompanied by 50 mm diameter hyperemia and/or in 15% of cases it was accompanied by 25mm infiltration. One volunteer vaccinated by the dose of 15µg of HA had such systemic reaction of slight intensity as pain in joints during 1 day, sore throat and cough during 7 days.
There were not significant differences in the frequency of undesirable effects (UE) after first and second vaccination in both groups. However, amount of UE in the group of volunteers injected with the vaccine containing 15 µg of active component was more than in group vaccinated with the low dose, est. ed. we observed dose-dependent differences in frequency of occurrence of local post vaccinal reactions. Serious side reactions were not registered. Therapeutic treatment was not required in all cases of undesirable effects. No volunteers were excluded from the study due to the appearance of UE. Serious UE during the trial were not observed.


According to European criteria of annual registration of seasonal inactivated influenza vaccines for persons in 18-60 age vaccination should result in 2,5 times increase of average geometric titer of antibodies, to 4-fold seroconversion in 40% and more of vaccinated persons and amount of persons having protective titers of antibodies should make 70%. It is worth noticing that criteria of H5N1 influenza vaccines immunogenic activity evaluation have not been determined yet.
Evaluation of immunogenic activity of Kazfluvac vaccine after one-time injection according to HAIT after 21 day post vaccination showed that in the volunteers group vaccinated with Kazfluvac in dose 7,5 µg HA portion of persons with 4-fold seroconversion was 66,7%; degree of antibodies titer increase was 3,4; seroprotection level – 16,7%, influenza virus A/H5N1 average geometric titers were 16,8%.
After two vaccinations in the volunteers group vaccinated with Kazfluvac 7,5 µg of HA we observed increase of all indices of vaccine immunogenic activity. The average geometric titers and degree of antibodies titer increase reached 28,0 and 5,7 accordingly. Seroprotection level reached 66,7%, portion of persons with 4-fold seroconversion was 75%. On application of the vaccine with high dose (15µg of HA) after first vaccination portion of persons with 4-fold seroconversion was 90,9%; degree of antibodies titers increase was 8,0; seroprotection level - 72,7% and average geometric antibodies titers to the A/H5N1 influenza virus was 40,0.
After two vaccinations in the volunteers group vaccinated with Kazfluvac 15µg of HA we also observed increase of the most indices of the vaccine immunogenic activity. The average geometric antibodies titers and degree of antibodies titer increase reached 54,4 and 10,9 accordingly; level of seroprotection reached 90,9% and portion of persons with 4-fold seroconversion was 90,9%. Results of micro neutralization test (MNT) matched the results of HAIT.
Table 4. Kazfluvac vaccine immunogenic activity

Preparation
(amount of persons) Amount of persons with 4-fold seroconversion Average geometric antibodies titers Degree of antibodies titers increase Amount of persons with protective antibodies titers (≥1:40)
Vaccination Vaccination Vaccination Vaccination
First Second First Second First Second First Second
MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT MNT
HAIT
Vaccine
7,5 µg НА
n=12 75,0

66,7 100,0

75,0 30,0

16,8 53,4

28,3 5,0

3,4 9,0

5,7 25,0

16,7 50,0

66,7
Vaccine
15 µg НА
n=12 81,8

90,9 100,0

90,9 58,4

40,0 117,6

54,4 9,7

8,0 18,7

10,6 54,5

72,7 90,9

90,9

According to the immunogenicity parameters and MNT and HAIT results with horse erythrocytes Kazfluvac vaccine containing 7,5 µg of HA per dose and 15µg of HA per dose after one-time injection complied with 2 of 3 European criteria of annual registration of seasonal inactivated influenza vaccines (IIV).
The results of study of reactogenicity, safety and immunogenicity of Kazfluvac vaccine in doses of 7,5µg and 15µg of HA per dose after one-time and double intramuscular immunization of 18-60 aged volunteers indicate good tolerance, low reactogenicity, safety and sufficient immunogenic activity of the vaccine in relation to the A/H5N1 influenza virus after one-time and double injection. The obtained results allow conducting the II phase of clinical trial aiming at the selection of optimal dose of Kazfluvac vaccine (7,5 or 15µg of HA per person) after one-time injection to 18-60 aged volunteers.

The main task of the II phase of clinical trial was the evaluation of the vaccine immunogenicity after one-time intramuscular injection. The evaluation of vaccine immunogenic activity indices has been implemented according to the following criteria: yield of HA-inhibiting antibodies in the blood-serum samples according to HAIT data, as well as yield of neutralizing antibodies in MNT on the 1st day before vaccination and 21st day after vaccination. Also, evaluation of safety and tolerance of Kazfluvac vaccine after one-time immunization has been conducted.
Thereto randomized blind clinical trial of one-time application of aluminum-adjuvanted whole virion inactivated influenza vaccine Kazfluvac on 18-60 aged volunteers has been conducted. Only volunteers who had antibodies titres < 1:10 to the A/H5N1 influenza virus subtype in HAIT and who was seronegative in ELISA to HIV and hepatitis C and B have been involved in the trial. 80 healthy volunteers have been involved in the trial. The vaccination of volunteers with Kazfluvac has been conducted in two dose levels (7,5 µg of HA or 15µg of HA per person)
This clinical trial has been implemented on two clinical bases: Influenza Research Institute Ministry of Health and Social Development of RF, St.Peterburg (40 volunteers) and Research Institute of Vaccines and Sera after the name of I.I. Mechnikov RAMS RF, Moscow (40 volunteers).
The following series of the vaccine have been used: s.1 – 7,5 µg of HA; s.1 - 15µg of HA containing 7,5 or 15 µg of HA accordingly. The vaccine has been injected one-time intramuscularly in volume of 0,5 ml in deltoid muscle of non-dominating hand on 1st day of trial. Vaccinated persons have been under thorough medical surveillance during 7 days after vaccination for evaluation of local and systemic reactions intensity. Registration of undesirable effects has been conducted prospectively during the whole period of trial.
The trial has been conducted with the participation of 80 healthy volunteers of both sexes and of age from 18 to 60. The volunteers complied with the inclusion/non-inclusion criteria. Age and sex distribution of the volunteers and their basic demographic data are presented in table 5.

Table 5. Age and sex distribution of volunteers.


Index Volunteers cohort Kazfluvac (7,5 µg НА) Kazfluvac (15 µg НА)
Total Women Men Total Women Men Total Women Men
Amount of persons 80 41 39 40 17 23 40 24 16

51,25% 48,75% 42,5% 57,5% 60,0% 40,0%
Age
(years) 35,3±11,4 36,9±11,25 33,5±11,4 34,4±11,0 35,1±9,8 33,8±12,0 36,1±11,8 38,6±12,2 33,1±11,0
Me 34,5 38,0 31,0 34,0 34,0 30,0 41,0 42,5 31,0
min 19,0 19,0 20,0 20,0 22,0 20,0 19,0 19,0 20,0
max 58,0 57,0 58,0 58,0 55,0 58,0 57,0 57,0 55,0
95%CI 32,7-37,8 33,4-40,5 29,8-37,2 30,8-37,9 28,5-39,1 28,5-39,1 32,4-39,8 33,1-43,4 27,4-38,7

According to demographic characteristics and age the volunteers have been distributed evenly in groups vaccinated with two different doses.
The evaluation of immunogenic activity of the vaccine on 21st day after one-time vaccination showed that in group of volunteers immunized with Kazfluvac vaccine in dose 7,5 µg of HA portion of persons with 4-fold seroconversion was 55%; seroprotection level – 55,5%; degree of antibodies titers increase was 3,4; average geometric antibodies titers to A/H5N1 influenza virus - 17,1.

In the volunteers group vaccinated with Kazfluvac 15 µg of HA we observed increase of all indices of vaccine immunogenic activity. Portion of persons with 4-fold seroconversion was 70%; the average geometric titers and degree of antibodies titer increase reached 23,4 and 4,68 accordingly. Seroprotection level reached 57,5%. The results of micro neutralization test matched the HAIT results.
On application of the vaccine with high dose (15µg of HA) according to MNT data we observed increase of all studied indices of the vaccine immunogenic activity: portion of persons with 4-fold seroconversion was 67,5%; degree of antibodies titers increase was 7,6; seroprotection level - 55% and average geometric antibodies titers to the A/H5N1 influenza virus was 42,87. This indicates dose-dependent character of antibodies response formation. HAIT and MNT results data of Kazfluvac vaccine immunogenic activity are presented in Table 6.

Table 6. Kazfluvac vaccine immunogenic activity.

Preparation
(amount of persons) Amount of persons with 4-fold seroconversion Average geometric antibodies titers Degree of antibodies titers increase Amount of persons with protective antibodies titers (≥1:40)
HAIT MNT HAIT MNT HAIT MNT HAIT MNT
Vaccine
7,5 µg НА
n=40 55,0 55,0 17,1 24,2 3,42 4,2 52,5 40,0
Vaccine
15 µg НА
n=40 70,0 67,5 23,38 42,87 4,68 7,6 57,5 55,0

To evaluate the safety of the vaccine undesirable effects analysis has been conducted on the basis of laboratory and instrumental surveillance (blood tension, heart rate, body temperature, ECG, hematologic, biochemical blood analysis, urine general analysis), results of physical observation and medical anamnesis.
Totally during the trial 29 UE have been observed in 29 of 80 vaccinated volunteers (36,25%). In 28 cases of UE correlation with the vaccine injection has been evaluated as probable and in one case as non-connected. Among all injection correlated UE 25 cases were represented by local reactions of slight intensity. In 100% of cases it was insignificant pain in the place of injection which lasted 2 days and it was not accompanied by hyperemia and infiltration. Pain disappeared without application of any medicals. One volunteer vaccinated with 7,5µg of HA had systemic reaction of slight intensity. He had rhinitis, tickling in the throat on 3-4 days after vaccination. Two volunteers vaccinated with 15µg of HA had systemic reactions of slight intensity. They had indisposition and tickling throat on the second day after vaccination and headache on the second day post vaccination. Undesirable effects of serious and middle intensity have not been registered.
Results of clinical and laboratory surveillance of volunteers including level of IgE on the 7th and 21st days post vaccination differed from primary results within normal physiologic values and irrespective of the vaccine dose.

CONCLUSION
Study of immunogenic activity, reactogenicity and safety of the vaccine Kazfluvac in doses 7,5 µg and 15 µg of HA after one-time intramuscular immunization of 18-60 aged volunteers indicates good tolerance, low reactogencity and safety of the vaccine as well as sufficient immunogenic activity of the vaccine in relation to A/H5N1 influenza virus. The obtained results allow recommending Kazfluvac vaccine containing 7,5 µg of HA per dose for state registration as prophylactic means for 18-60 aged people protection from influenza A of H5N1 subtype.


REFERENCES
1. Federal law concerning medical agents # 122-F3 signed 22.08.2004
2. Order of Ministry of Health of RF # 266 signed 19.06.2003 “Rules of Clinical Practice in Russian Federation”
3. National standard of Russian Federation “Good Clinical Practice” # 232-st. signed 27 September, 2005.
4. Yu. B. Beloussov “Planning and Implementing of Clinical Trials of Medical Agents” М. 2000.
5. Li, H., Nookala, S. & Re, F. (2007). Aluminum hydroxide adjuvants activate caspase-1 and induce IL-1 beta and IL-18 release. J Immunol 178, 5271-5276.
6. Vajo Z, Wood J, Koza L, Szilvasy I, Paragh G, Pauliny Z, Bartha K, Visontay I, Kis A, Jankovcs I. A single-dose influenza A (H5N1) vaccine safe and immunogenic in adult and eldery patients: an approach to pandemic vaccine development. J Virol. 2010; 84(3):1273-42
7. Fazekas G, Martosne-Mendi R, Jankovcs I, Szilvasy I, Vajo Z. Cross-reactive immunity to clade 2 strains of influenza virus A subtype H5N1 induced in adults and eldery patients by Fluval, a prototype pandemic influenza virus vaccine derived by reverse genetics, formulated with a phosphate adjuvant, and directed to clade 1 strains. Clin Vaccine Immunol. 2009 16(4):437-43
8. Seidigapbar M. Mamadaliyev, Nurlan T. Sandybayev, Zhailaubay K. Kydyrbayev, Berik M. Khairullin, Oleg I. Kiselev, Ludmila M. Tsybalova, Michail P. Grudinin, Aleksandr I. Migunov. Basic results of development of a production technology and control of a pandemic influenza A/H5N1 vaccine. Influenza and Respiratory Viruses, 5 (Suppl.1), 328-394
9. Seidigapbar M. Mamadaliyev, Nurlan T. Sandybayeiv, Yevgeni N. Troitskiy, Zhailaubay K. Kydyrbayiev, Berik M. Khairullin, Oleg I. Kisselev, Liudmila M. Tsybalova, Kenes S. Ospanov, Stanislav V. Kazakov. The Development of Native Vaccine and Diagnostic Biopreparations against Influenza A/H5N1 and A/H1N1 – the Basis of Biologic Safety and Protection for Population of the Republic of Kazakhstan. Proc. “AntiInfluenza Vaccines of New Generation”, St. Peterburg 28-29 October, 2009 P. 4-11
10. Methods of Control of Medical and Immune Biological Preparations Injected to Humans. Methodic Instructions MUK 4.1/4.2.588-96 (Approved GOSCOMEPIDNADZOR RF 31.10.1996)
11. RD 42-28-10-90. “Order and Methods of Control of Immune Biological Safety of Vaccines. General Methodic Principles”, Moscow – 1989